Tahap-Tahap Pengujian Bakteri

Metode Pewarnaan Bakteri

Bakteri dibiakkan di atas media dengan susunan-susunan tertentu. Bakteri juga di uji kemampuannya untuk menahan zat warna crystal violet, dengan prosedur yang telah di ciptakan oleh Christian Gram. Jika setelah di cuci bakteri dapat menahan zat warna tersebut bakteri akan berwarna biru dan disebut gram positif, atau bereaksi positif terhadap pewarnaan dengan cara gram. Jika tidak berwarna biru, bakteri disebut gram negatif.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat	Gram Positif	Gram Negatif
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan warna basa	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrien	Kompleks	Relatif sederhana
Ketahanan terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

Bakteri yang termasuk gram negatif adalah Enterobactericeae, Salmonella spp, Shigella spp, E. Coli, Yersinia enterolitica.

Sedangkan bakteri gram positif adalah Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Clostridium, Bacillus. 

Teknik Pewarnaan Bakteri 

1.    Mengamati Morfologi Bakteri

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.

2. Jenis Pewarnaan

Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :

2.1 Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin. yang man pewarnaan sederhana ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan :

a.      a. Pewarnaan Asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk hanya untuk melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru metilen, dan air furksin.

Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. 

Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi, lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.

2.2 Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam pewarnaan gram, yaitu kristal violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:

1. Larutan violet kristal hucker (1 tetes) sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglika bakteri.
2. Iodin (1 tetes) sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama
3. Ethanol 95% (secukupnya sampai cat utama luntur), sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama
4. Safranin (1 tetes) sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan warna cat utamanya

Langkah-Langkah Pengujian Bakteri :

1.      Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api Bunsen.

2.      Membuat olesan tipis bakteri dengan mengambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan diberi 1-2 tetes aquadest.

3.      Olesan tersebut dibubuhi kristal violet (Gram A = cat utama), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering.

4.      Dibubuhi dengan larutan iodin (Gram B = larutan mordan), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering.

5.      Melakukan dekolorisasi dengan dibubuhi etil alkohol 95% selama 10-20 detik, segera aliri dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan aktivitas dekolorisasi, dianginkan hingga kering

6.      Olesan bakteri ditetesi dengan safranin selama 20-30 detik, dicuci dengan air mengalir selama beberapa detik untuk menghabiskan sisa-sisa cat. Selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan kering anginkan
7.      Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri.

Teknik Pewarnaan Gram

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

           1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Pada saat pemberian larutan cat kristal violet, bakteri gram positif dan negatif sama-sama berwarna ungu. Saat ditetesi iodin, pada gram positif terbentuk kompleks iodin kristal violet sehingga sel berwarna biru, demikian juga gram negatif. Namun setelah pencucian dengan etanol warna ungu yang diikat oleh bakteri gram negatif luntur, sedangkan pada bakteri gram negatif tidak. Pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram posotif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasm sehingga sel tetap biru/ungu. Saat penambahan safranin, bakteri gram negatif mengikatnya sedangkan gram negatif melewatkannya.

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).

2.3 Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb.

Contoh, Pewarnaan khusus :

a.       Pewarnaan Endospora

Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora dengan metode Schaeffer-Fulton. 

Source :

http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif/

http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/

Diagnosis Penyakit Tanaman

Diagnosis penyakit yang benar diperlukan untuk merekomendasikan cara pengendalian yang tepat dan juga diperlukan dalam suatu survei penyakit tanaman. Dalam hal ini diagnosis dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri, cendawan, virus ataupun  organisme antagonis dan produk metabolitnya.

Diagnosis penyakit tanaman berdasarkan gejala saja belum memadai atau tidak cukup.  Hal ini karena untuk  mengidentifikasi suatu penyakit disebabkan banyak organisme  yang berbeda dapat menunjukkan  gejala yang sama pada inang yang diinfeksinya.  Dalam hal ini perlu diperhatikan kemungkinan kemungkinan adanya organisme  sekunder atau saprofit yang turut serta menginfeksi bagian tanaman.

Untuk mendiagnosis penyakit tumbuhan pertama kali perlu ditentukan  apakah penyakit tersebut disebabkan oleh bakteri,jamur, virus atau lainnya atau faktor lingkungannya.

Diagnosis penyakit tanaman dan identifikasi  penyebab penyakit pada tanaman yang mempunyai nilai ekonomis yang tinggi maka diagnosis yang lebih akurat sangat diperlukan. Hal ini dapat dicapai melalui prosedur isolasi dan seleksi patogen dan jika perlu dilakukan konfirmasi pengujian pada tanaman inang yang sesuai.

Langkah dalam bidang diagnosis:

1. Tentukan nama ilmiah serta nama umum dari tanaman yang akan di diagnosis. 
2. Menentukan penyakit apa yang terdapat pada tanaman yang sakit tersebut.
3. Bandingkan tanaman sakit dengan tanaman yang tumbuh sehat di dekatnya untuk menilai lebih baik gejala dan tanda-tanda. 
4. Menentukan distribusi penyakit di dalam lapangan atau kebun. Apakah  ada lebih dari satu jenis tanaman yang terkena. Kita harus tahu apakah pada ahan tersebut bagian tanaman yang terkena seluruh bagian tanaman atau hanya pada bagian tertentu saja. Jika seluruh bagian tanaman terkena bisa saja di sebabkan oleh kekurangan unsur hara.
5. Apakah tanaman tersebut merupakan tanaman yang sama dengan tanaman yang sebelumnya di tanam,apakah tanaman yang lain juga terserang? apakah ada penggunaan pestisida di lokasi tersebut? apakah pernah terjadi iklim yang terlalu panas atau terlalu dingin?
6. Kita harus memeriksa seluruh baguan tanaman,baik akar,batang,daun,bunga dan buah untuk melihat gejala yang di timbulkan
7. Perhatikan juga faktor iklim saat itu untuk mengetahui iklim yang mempengaruhi
8. Apakah gejala hanya terdapat pada daun, batang, bunga atau buah, atau seluruh tanaman yang terlihat
9. Jika penyebab kondisi tidak dapat langsung tentukan, Anda mungkin perlu meminta bantuan dari agen daerah. Kadang-kadang gejala dan tanda-tanda tidak cukup karakteristik untuk memungkinkan diagnosis yang akurat dari masalah. Dalam kasus ini, sampel mungkin harus diambil untuk mengisolasi dan mengidentifikasi agen penyebab.

Tahapan dalam diagnosis penyakit tanaman

• Amati gejala yang terjadi pada tanaman
• Pilih bagian tanaman sakit yang memperlihatkan gejala belum terlalu rusak atau busuk dan jangan juga memilih bagian yang meninjukkan gejala awal. . Gejala yang terlalu lanjut biasanya sudah ditumbuhi cendawan serta bakteri saprofit yang sering kalimengganggu pertumbuhan. Gejala yang terlalu awal juga menyulitkan diagnosa karena sukar memperoleh tanda penyakit
• Selain melihat gejala kita juga harus memperhatikan tanda untuk memperkuat hasil diagnosa
• gejala dan tanda penyakit yang belum di kenal sebiaknya di lakukan penelitian lebih lanjut. Perlu di lakukan penhujian untuk membuktikan hipotesis bahwa mikroorganisme tersebut penyebab penyakit dengan serangkaian postulat koch
• Gejala yang disertai tanda keberadaan penyebab penyakit dapat dilakukan identifikasi lebih lanjut di laboratorium.

Diagnosis Penyakit Tanaman oleh Bakteri

Bakteri adalah mikroorganisme berukuran kecil namun dapat terlihat dengan mikroskop kompon seperti bentuk batang-batang kecil. Identifikasi bakteri sulit dilakukan jika hanya berdasarkan karekter morfologisnya.

 
Kelompok bakteri disebut koloni. Koloni dapat mempunyai bentuk dan warna yang berbeda-beda. Bakteri memiliki bentuk flagel yang bermacam-macam diantaranya :

1. Monotrik bakteri dengan satu falgel
2. Lofotrik yaitu bakteri yang memilki banyak falgel di satu ujungnya.
3. Peritrik yang memiliki banyak falgel di sekeliling tubuhnya. Dll

Identifikasi bakteri terutama di dasarkan atas fisiologisnya, yaitu dengan cara bakteri dibiakkan di atas media dengan susunan-susunan tertentu. Bakteri juga di uji kemampuannya untuk menahan zat warna crystal violet, dengan prosedur yang telah di ciptakan oleh Christian Gram. Jika setelah di cuci bakteri dapat menahan zat warna tersebut bakteri akan berwarna biru dan disebut gram positif, atau bereaksi positif terhadap pewarnaan dengan cara gram. Jika tidak berwarna biru, bakteri disebut gram negatif.

Diagnosis penyakit bakteri dan identifikasi bakteri penyebab penyakit didasarkan pada gejala awal penyakit yang tampak pada tanaman terinfeksi, jumlah populasi bakteri pada area terinfeksi, dan ketidakberadaan patogen penyebab lainnya.

Pada saat bakteri berada pada jaringan tanaman sakit, ada dua kemungkinan yang terjadi yaitu :

• Bakteri tersebut adalah patogen penyebab utama penyakit pada tanaman tersebut, atau 
• Bakteri tersebut merupakan salah satu bakteri saprofitik atau bakteri yang dapat tumbuh pada jaringan yang telah mati.

Identifikasi bakteri sulit dilakukan jika hanya berdasarkan karekter morfologisnya. Isolasi bakteri pada media agar memerlukan kehati-hatian yang tinggi sehingga terhindar dari kontaminasi bakteri saprofit.

Cara termudah dan terpercaya untuk membuktikan bahwa bakteri tersebut adalah patogen penyebab adalah melalui isolasi koloni tunggal dan menumbuhkan bakteri pada media, untuk selanjutnya diinokulasi kembali pada tanaman inang yang peka.

Uji Postulat Koch

Langkah-langkah pengujian Postulat Koch adalah sebagai berikut :

• Organisme (bakteri) harus ditemukan berasosiasi dengan gejala penyakit yang ada (bagian tanaman yang sakit diuji).
• Organisme harus dapat diisolasi dari jaringan yang sakit dan dapat dibuat biakan murni.
• Organisme dari biakan murni harus dapat diinokulasikan pada tanaman inang yang sehat dan menghasilkan gejala penyakit yang sama dengan gejala pada tanaman sebelumnya.
• Organisme harus dapat diisolasi kembali (reisolasi) dari tanaman yang di Inokulasi dan hasilnya harus sama dengan organisme yang dipakai untuk inokulasi.

Klinik Tanaman

Oleh :
Septiana Anggraini     
05081005020
Dosen Pengasuh : Dr.Ir.Hj. Nurhayati, M.Si.    


Klinik tanaman adalah suatu wadah dimana terjadi suatu pelayanan pada masyarakat yang berhubungan dengan gangguan pada tanaman yang diusahakan.

Fungsi Klinik Tanaman

1. Menyebarkan teknologi Pengelolaan Hama Terpadu kepada petani dan institusi lain.

2. Wadah bagi staf pengajar dan mahasiswa untuk manangani permasalahan hama dan penyakit tanaman.

3. Wadah mekanisme respon baik bagi masyarakat tentang apa yang ada dalam petani dan kliennya yang dapat menjadi bahan penelitian dan memperkaya dalam pengajaran di kelas.

Melalui klinik tanaman, petani dan petugas tanaman dapat berdiskusi secara mendalam tentang pengelolaan pertanaman mereka untuk mendapatkan hasil yang sehat dan optimal dengan meminimumkan kerusakan terhadap ekosistem lingkungan. 

Pengendalian penyakit yang efektif terutama tergantung pada awal identifikasi akurat penyakit dan agen kausal. Dalam kebanyakan kasus, hal itu sudah terlibat untuk mengendalikan penyakit pada tanaman setelah penyakit muncul. Namun, langkah-langkah pengendalian yang tepat dapat mencegah penyakit menyebar ke tempat lain.

Bidang diagnose masalah penyakit yang melibatkan beberapa pekerjaan detektif mencari gejala, tanda-tanda, dan pola. Gejala respon tanaman tekanan tertentu yang mungkin disebarkan oleh lingkungan oleh pathogen.

Klinik tanaman atau sering juga disebut laboratorium diagnose penyakit tanaman umumnya dilengkapi dengan para ahli dan petugas atau dapat juga dari mahasiswa yang magang, yang melakukan penyuluhan atau pendidikan dibidang penyakit tanaman.

Langkah dalam pelayanan di klinik tanaman adalah sebagai berikut :

1. Pengambilan sample

    Ambil sample yang akan diidentifikasi lanjut

2. Identifikasi

    Lakukan identifikasi secara morfologi terlebih dahulu, dan dapatkan hasil pendugaan

3. Isolasi

    Untuk memastikan benar atau salahnya pendugaan pada identifikasi, lakukan isolasi.

4. Reisolasi

5. Permurnian

6. Rekomendasi Pengendalian

        Pengambilan keputusan pengendalian apa yang harus dilakukan atau memberikan pilihan pengendalian yang tepat.

L